本发明提供了包含Gd.DOTA.DSA(2-{4,7-二羧甲基-10-[(N,N-二硬脂酰氨基甲基-N`-酰氨基-甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基}-乙酸钆(III))的新型脂质体,其特征在于,所述脂质体还包含中性的完全饱和磷脂组分(例如DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱]),其特别适用于制备用于增强哺乳动物中的肿瘤的磁共振图像的磁共振造影剂。
1.一种脂质体,所述脂质体包含2-{4,7-二羧甲基-10-[(N,N-二硬脂酰氨基甲基-N`-酰氨基-甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基}-乙酸钆(III),其特征在于,所述脂质体还包含中性的完全饱和磷脂组分。
2.根据权利要求1所述的脂质体,其中所述完全饱和磷脂组分是1,2-二(C₁₂-C₂₀饱和脂质)-sn-甘油-3-磷酰胆碱,其中所述饱和脂质基团彼此能够相同或不同。
3.根据权利要求1所述的脂质体,其中所述完全饱和磷脂组分是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的脂质体,其中所述脂质体还包含胆固醇。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的脂质体,其中所述脂质体还包含聚乙二醇-磷脂组分。
6.根据权利要求5所述的脂质体,其中所述聚乙二醇-磷脂是二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(2000)。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的脂质体,其中所述脂质体中的2-{4,7-二羧甲基-10-[(N,N-二硬脂酰氨基甲基-N`-酰氨基-甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基}-乙酸钆(III)的量为总脂质体制剂的29-31mol%。
8.根据权利要求1-3中任一项所述的脂质体,其中所述脂质体中的2-{4,7-二羧甲基-10-[(N,N-二硬脂酰氨基甲基-N`-酰氨基-甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基}-乙酸钆(III)的量为总脂质体制剂的30mol%。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的脂质体,其中所述脂质体中的完全饱和磷脂组分的量为总脂质体制剂的32-34mol%。
10.根据权利要求1-3中任一项所述的脂质体,其中所述脂质体中的完全饱和磷脂组分的量为总脂质体制剂的33mol%。
11.根据权利要求1-3中任一项所述的脂质体,其中所述脂质体中的胆固醇的量为总脂质体制剂的29-31mol%。
12.根据权利要求1-3中任一项所述的脂质体,其中所述脂质体中的胆固醇的量为总脂质体制剂的30mol%。
13.根据权利要求5所述的脂质体,其中所述脂质体中的所述聚乙二醇-磷脂组分的量为总脂质体制剂的5-8mol%。
14.根据权利要求5所述的脂质体,其中所述脂质体中的所述聚乙二醇-磷脂组分的量为总脂质体制剂的7mol%。
15.根据权利要求1-3中任一项所述的脂质体,其中所述脂质体在磷酸盐缓冲溶液中稀释10倍时具有小于或等于100nm的平均粒度。
16.根据权利要求1-3中任一项所述的脂质体,其中所述脂质体在磷酸盐缓冲溶液中稀释10倍时具有小于或等于80nm的平均粒度。
17.根据权利要求1所述的脂质体,其中所述脂质体包含2-{4,7-二羧甲基-10-[(N,N-二硬脂酰氨基甲基-N`-酰氨基-甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基}-乙酸钆(III)、胆固醇、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(2000)。
18.根据权利要求17所述的脂质体,其中2-{4,7-二羧甲基-10-[(N,N-二硬脂酰氨基甲基-N`-酰氨基-甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基}-乙酸钆(III)、胆固醇、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(2000)分别以比例30:33:30:7mol%存在于所述脂质体制剂中。
19.根据权利要求1-3中任一项所述的脂质体,其中所述脂质体还包含肿瘤靶向剂。
20.根据权利要求19所述的脂质体,其中所述肿瘤靶向剂包含受体的配体,相对于所述受体在哺乳动物的非肿瘤组织细胞中的表达,所述受体在肿瘤细胞中过表达。
21.根据权利要求19所述的脂质体,其中所述肿瘤靶向剂包含叶酸部分。
22.根据权利要求19所述的脂质体,其中所述肿瘤靶向剂是磷脂-聚乙二醇-叶酸化合物。
23.根据权利要求22所述的脂质体,其中所述磷脂-聚乙二醇-叶酸化合物是二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(2000)-叶酸。
24.根据权利要求21所述的脂质体,其中在所述脂质体中存在的所述叶酸部分的量为总脂质体制剂的1-2mol%。
25.根据权利要求19所述的脂质体,其中所述脂质体包含2-{4,7-二羧甲基-10-[(N,N-二硬脂酰氨基甲基-N`-酰氨基-甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基}-乙酸钆(III)、胆固醇、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(2000)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(2000)-叶酸。
26.根据权利要求25所述的脂质体,其中2-{4,7-二羧甲基-10-[(N,N-二硬脂酰氨基甲基-N`-酰氨基-甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基}-乙酸钆(III)、胆固醇、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(2000)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(2000)-叶酸分别以比例30:33:30:5.5:1.5mol%存在于所述脂质体制剂中。
27.一种磁共振造影剂,所述磁共振造影剂包含权利要求1-26中任一项所述的脂质体和药用载体。
28.根据权利要求27所述的磁共振造影剂,其中所述药用载体是水性载体。
29.根据权利要求27或权利要求28所述的磁共振造影剂,用于医学中。
30.根据权利要求27或权利要求28所述的磁共振造影剂,其用于诊断中。
31.根据权利要求1-26中任一项所述的脂质体在制备磁共振造影剂中的应用,所述磁共振造影剂用于增强哺乳动物中的器官和器官结构的磁共振图像。
32.根据权利要求31所述的应用,用于制备增强哺乳动物中的肿瘤的磁共振图像的磁共振造影剂。
33.根据权利要求31或32所述的应用,其中所述磁共振造影剂中的所述脂质体的浓度为1-50mg/mL。
34.根据权利要求31或32所述的应用,其中所述磁共振造影剂中的所述脂质体的浓度为1-30mg/mL。
35.一种制备权利要求1-26中任一项所述的脂质体的方法,所述方法包括混合2-{4,7-二羧甲基-10-[(N,N-二硬脂酰氨基甲基-N`-酰氨基-甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基}-乙酸钆(III)的溶液和中性的完全饱和磷脂的溶液以形成混合物。
36.根据权利要求35所述的方法,所述方法还包括以下步骤:干燥所述混合物。
37.根据权利要求35所述的方法,所述方法还包括以下的步骤:干燥所述混合物并再水合所得到的脂质体。
38.根据权利要求36或37所述的方法,其中所述干燥所述混合物的步骤包括在真空下干燥所述混合物。
39.根据权利要求36所述的方法,其中所述干燥所述混合物的步骤包括在真空下干燥所述混合物。
40.根据权利要求37所述的方法,其中所述干燥所述混合物的步骤包括在真空下干燥所述混合物。
41.一种制备权利要求27或权利要求28所述的磁性造影剂的方法,所述方法包括混合在权利要求1-26中任一项定义的脂质体和药用载体。发明领域本发明涉及适用于制备造影剂的新型脂质体,所述造影剂用于增强磁共振成像(MRI),特别是用于增强肿瘤的磁共振图像。发明背景癌症成像是最重要的疾病领域之一,其中分子成像被设置为在癌症的检测和随后的治疗中起重要作用。对于通过磁共振成像(MRI)的有效癌症成像,显然需要开发有效且生物相容性的分子成像探针<sup>1,2</sup>。在此领域中,纳米技术做出了巨大贡献,因为纳米药物被设置为在药物递送、疾病检测以及治疗的重要领域做出了重要贡献。纳米技术平台在癌症成像中的应用,已经开启了在癌症检测和治疗的研究中使用多功能的纳米颗粒系统(诸如脂质体)的机会。MRI是一种临床成像模式,其产生含有水的组织的三维不透明图像。当今世界上超过40%的临床成像需要注射某种形式的MRI造影剂。这是由于以下事实:MRI存在固有的灵敏度缺乏,且经常为了正确地诊断病状,将顺磁性造影剂静脉内地注入患者,以进一步增强磁共振(MR)信号,并因此增强疾病的部位。这些试剂由掺入了顺磁性金属离子,最通常是钆或铁的分子组成。由于配位金属离子对周围大量水质子的纵向(T<sub>1</sub>)或横向(T<sub>2</sub>)弛豫时间的增强效应,而产生图像改善。掺入了钆的造影剂会增大1/T<sub>1</sub>和1/T<sub>2</sub>,但是通常被用于T<sub>1</sub>-加权成像中,其中它们在组织中的1/T<sub>1</sub>效应大于它们的1/T<sub>2</sub>增强<sup>3</sup>。另一方面,含有铁的试剂会导致1/T<sub>2</sub>的更大幅增加,并因此用T<sub>2</sub>-加权图像显影(可视化,visualise)。基于钆的MRI造影剂的使用产生正像增强(在图像上的亮信号),而铁试剂的使用导致负像增强(图像的变暗)。Gd.DTPA[钆(III)-二亚乙基三胺五乙酸盐复合物](图1)是自1988年中期以来被FDA(食品药品管理局)批准用于临床使用的第一种水溶性的、肾可排泄的造影剂,并且目前常规地以商业名称马根维显ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="28"/>(Magnevistntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="28"/>)使用<sup>4</sup>。图1显示了在临床中最常用的造影剂的几个实例。这些化合物通常是惰性的稳定复合物,其中金属离子与聚(氨基羧化物)配体强烈螯合。这些类型的试剂是非特异性的,主要停留在血流内,且也在肾脏中积累(由于它们的肾小球过滤),并通常不经代谢地排泄。尽管如此,它们在临床MR成像中的应用具有极大的价值,因为可以使解剖学的异常如神经胶质瘤和脑内的病变显影,而在正常生理条件下,这些试剂不会穿过完整的血脑屏障。也可以使肝脏和其它器官内的病状显影,因为这些造影剂会快速地积累在间质间隙中,并因此可以在这样的增加流体体积的区域中增大信噪比。然而,由于这些试剂是非特异性的,且在注射的几小时内被清除,所以它们在MR成像中的利用限于短成像时间窗,且主要限于血池的增强。最近,在分子成像领域内已经做出许多工作,以改善MRI造影剂的性质,这已经导致使用聚合物、树形化合物和各种纳米颗粒作为Gd载体。我们已经合成了我们自己的新型MRI活性脂质的库。这些脂质随后已经被用来配制用于肿瘤成像的脂质体。脂质体由脂质成分组成,具有亲水头基和疏水尾基(图2)。当水合时,这些脂质聚集到一起而形成自装配的双层囊泡,所述囊泡包封一个水性隔室(aqueousxa0compartment)。由于此水性腔,它们已经传统地被用作药物递送媒介物,其囊化水溶性药物以改善药物药代动力学。另外,还已经将核酸浓缩到脂质体制剂中,用于有效的转染和基因递送。尽管具有这些额外的功能,但脂质体最初作为生物膜的模型被研究,并且这是在实现它们的生物相容性中的一个关键构思。可以改变脂质体的多用途性质,以改变它们与各种分子或甚至更大的结构如细胞的相互作用。这可以如下实现:通过将具有高度带电荷的极性头基的脂质掺入脂质体制剂中而改变脂质体表面的总电荷,例如,阳离子脂质向掺入所述制剂中会产生阳离子脂质体。阳离子脂质已经被用来配制用作体外和体内基因递送系统的脂质体/DNA复合物(脂复合物)。脂质体通常通过它们的尺寸、形状和层状性(lamellarity)来表征。它们可以由单个双层(单层状)、几个双层(寡层状)或多个双层(多层状)组成。通过使用合适的脂质,可以调节膜的刚度;并且通过使用具有高或低相变温度的磷脂,可以改变膜的流动性。一般而言,硬脂酸(完全饱和的C18脂链)的脂质衍生物会赋予膜刚度和不透性,而油酸(不饱和的C18脂链)的脂质衍生物导致产生更可透过的且更低稳定性的脂质双层。通过将钆脂质掺入脂质体的膜中,可以使它们成为MRI可见的,并可以获得具有更好的尺寸控制的系统<sup>5</sup>。脂质体非常适合作为钆进入细胞中的高有效负荷的载体。两性钆复合物掺入到脂质体膜中已经产生了顺磁性标记的脂质体,所述脂质体会显著地增强质子弛豫率。这些顺磁性脂质体已经用于许多研究中,包括细胞标记和跟踪的研究<sup>6</sup>。Kabalka等人在20年前证实了钆脂质掺入到脂质体制剂中,并且在他们的研究中使用的钆脂质Gd.DTPA.BSA[钆(III).二亚乙基三氨基五乙酸-二(硬脂酰胺)]现在经常被用于制备顺磁性脂质体<sup>7</sup>。调节脂质体尺寸、表面电荷和特异性的能力允许有效的病理学成像,如体内实体瘤的成像。通过调节脂质体制剂的组成,使得脂质体的这种调节成为可能。趋于中性的表面电荷最适合体内目的以便减少通过血浆蛋白和网状内皮系统(RES)对脂质体颗粒的识别。这可以通过在脂质体制剂中包含电荷中性的脂质来实现。以前的工作已经证实,新型钆脂质Gd.DOTA.Chol(钆(III).1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N′,N′′,N′′′-四乙酸根-胆固醇)(参见图3)是有效的MR信号增强剂,以及MAGfect(一种含有该钆脂质的脂质体制剂)是有效的细胞双重标记和转染媒介物<sup>6</sup>。尽管是相对有效的细胞标记脂质,但已经发现,使用该脂质的高脂质体浓度的制剂是有问题的,这可能是由于胆固醇尾部在高浓度的脂质体双层中的较差锚定。因此,由于此限制,需要提供更牢固的设计用于其中要更高脂质体浓度的体内应用的膜锚定,这导致替代性的饱和烷基链部分代替胆固醇锚定的研究。为此目的,使用溶液和固相化学的组合,合成了顺磁性脂质Gd.DOTA.DSA(2-{4,7-二羧甲基-10-[(N,N-二硬脂酰氨基甲基-N`-酰氨基-甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基}-乙酸钆(III))(参见图4)。经由稳定的且可生物降解的酰胺官能团,DOTA螯合物结合至脂质。该钆脂质还被设计成具有在钆螯合剂和脂质烷基链部分之间的5原子间隔物。认为在头基和脂质烷基尾之间的这种间隔是最佳的,以便确保钆螯合物最大暴露于脂质体颗粒的亲水性表面上的水。此外,这种钆脂质还被设计成具有DOTA配体,而不是更常用的DTPA[二亚乙基三氨基五乙酸],因为前一种大环配体被认为是更有效的钆的螯合剂,能够甚至在核内体的酸性环境中保留金属离子⁸。选择FDA批准的Gd.DOTA螯合物,因为由于它们更高的稳定性常数,所以已知的是,基于DOTA的结合物与DTPA配体相比在体内更稳定。MRI效力为了确立Gd.DOTA.DSA的弛豫性质,进行了在水溶液中的脂质的MRI研究,以毫秒为单位产生T₁值和弛豫率参数。将钆脂质Gd.DOTA.DSA的效力与临床造影剂马根维显ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="28"/>(Scheringxa0AG)和Gd.DTPA.BSA进行比较(参见表1),且发现在临床相关剂量上相比是有利地。这些数据也表明,Gd.DOTA.DSA具有与广泛使用的Gd.DTPA.BSA脂质相当的、甚至稍微更好的T₁弛豫。使用标准的T₁饱和恢复方法(自旋回波序列)来确定T₁值(根据方程1),其中x是TR(重复时间),而Si是对于给定的TR的测量信号。S_i=S₀(1-e^(-x/T1))方程式1:用于确定T₁值的T₁饱和恢复方程。表1显示了合成的Gd脂质以及有关的对照的T₁弛豫值。ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>表1.Gd.DOTA.DSA和Gd.DTPA.BSA与相关对照的T₁值和图像已经发现,使用Gd.DOTA.DSA,有可能成功地配制阳离子型脂质体和中性脂质体,并已经研究了这些脂质体的稳定性、体外毒性、体外转染和体内肿瘤成像能力[参见Kamaly等人2009:Bioconjugxa0Chem.2009年4月;20(4):648-55,和Kamaly等人2008:Bioconjugxa0Chem.2008年1月;19(1):118-29.2007年11月7日电子公开]。Kamaly等人已经进一步开发了两种中性的聚乙二醇化(PEG化)脂质体,除了增加的稳定性之外,所述脂质体具有优良的在体内肿瘤MR信号增强能力。这些颗粒也掺入Gd.DOTA.DSA。这些脂质体含有不饱和磷脂DOPC(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱),其结构为如下:ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>然而,仍然需要牢固且稳定的包含钆的脂质体纳米颗粒,其具有优良的在体内肿瘤MR信号增强能力。具体地,需要这样的脂质体:所述脂质体的性质为使得它们优化所述脂质体在实体瘤中的积累,同时使它们在身体器官诸如肝脏中的积累最小化,从而增强它们的MR信号增强效应,同时极大地减小这些钆脂质体的毒性,并提高它们的安全性。我们已经开发了满足这些需要的包含Gd.DOTA.DSA的新型脂质体。发明描述在本发明的第一个方面,提供了(1)包含Gd.DOTA.DSA(2-{4,7-二羧甲基-10-[(N,N-二硬脂酰氨基甲基-N`-酰氨基-甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基}-乙酸钆(III))的脂质体,其特征在于,所述脂质体还包含中性的完全饱和磷脂组分。本发明的该第一个方面的脂质体的优选方面包括:(2)根据(1)所述的脂质体,其中所述完全饱和磷脂组分是1,2-二(C<sub>12</sub>-C<sub>20</sub>饱和的脂质)-sn-甘油-3-磷酰胆碱,其中所述饱和的脂质基团可以彼此相同或不同。(3)根据(1)所述的脂质体,其中所述完全饱和磷脂组分是DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱)。(4)根据(1)至(3)中任一项所述的脂质体,其中所述脂质体还包含胆固醇。(5)根据(1)至(4)中任一项所述的脂质体,其中所述脂质体还包含聚乙二醇-磷脂组分。(6)根据(5)所述的脂质体,其中所述聚乙二醇-磷脂是DSPE-PEG(2000)[二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(2000)]。(7)根据(1)至(6)中任一项所述的脂质体,其中所述脂质体中的Gd.DOTA.DSA的量为总脂质体制剂的29-31mol%。(8)根据(1)至(6)中任一项所述的脂质体,其中所述脂质体中的Gd.DOTA.DSA的量为总脂质体制剂的30mol%。(9)根据(1)至(8)中任一项所述的脂质体,其中所述脂质体中的完全饱和磷脂组分的量为总脂质体制剂的32-34mol%。(10)根据(1)至(8)中任一项所述的脂质体,其中所述脂质体中的完全饱和磷脂组分的量为总脂质体制剂的33mol%。(11)根据(1)至(10)中任一项所述的脂质体,其中所述脂质体中的胆固醇的量为总脂质体制剂的29-31mol%。(12)根据(1)至(10)中任一项所述的脂质体,其中所述脂质体中的胆固醇的量为总脂质体制剂的30mol%。(13)根据(1)至(12)中任一项所述的脂质体,其中所述脂质体中的所述聚乙二醇-磷脂组分的量为总脂质体制剂的5-8mol%。(14)根据(1)至(12)中任一项所述的脂质体,其中所述脂质体中的所述聚乙二醇-磷脂组分的量为总脂质体制剂的7mol%。(15)根据(1)至(14)中任一项所述的脂质体,其中所述脂质体在磷酸盐缓冲溶液中稀释10倍时具有小于或等于100nm的平均粒度。(16)根据(1)至(14)中任一项所述的脂质体,其中所述脂质体在磷酸盐缓冲溶液中稀释10倍时具有小于或等于80nm的平均粒度。(17)根据(1)所述的脂质体,其中所述脂质体包含Gd.DOTA.DSA、胆固醇、DSPC和DSPE-PEG(2000)。(18)根据(17)所述的脂质体,其中Gd.DOTA.DSA、胆固醇、DSPC和DSPE-PEG(2000)分别以比例30∶33∶30∶7mol%存在于所述脂质体制剂中。在本发明的第二方面,提供了:(19)根据(1)至(17)中任一项所述的脂质体,其中所述脂质体还包含肿瘤靶向剂。包含肿瘤靶向剂的优选脂质体包括:(20)根据(19)所述的脂质体,其中所述肿瘤靶向剂包含受体的配体,相对于所述受体在哺乳动物的非肿瘤组织的细胞中的表达,所述受体在肿瘤细胞中过表达。(21)根据(20)所述的脂质体,其中所述肿瘤靶向剂包含叶酸部分。(22)根据(20)所述的脂质体,其中所述肿瘤靶向剂是磷脂-聚乙二醇-叶酸化合物。(23)根据(22)所述的脂质体,其中所述磷脂-聚乙二醇-叶酸化合物是DSPE-PEG(2000)-叶酸[二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(2000)-叶酸]。(24)根据(21)至(23)中任一项所述的脂质体,其中在所述脂质体中存在的所述叶酸部分的量为总脂质体制剂的1-2mol%。(25)根据(19)所述的脂质体,其中所述脂质体包含Gd.DOTA.DSA、胆固醇、DSPC、DSPE-PEG(2000)和DSPE-PEG(2000)-叶酸。(26)根据(25)所述的脂质体,其中Gd.DOTA.DSA、胆固醇、DSPC、DSPE-PEG(2000)和DSPE-PEG(2000)-叶酸分别以比例30∶33∶30∶5.5∶1.5mol%存在于所述脂质体制剂中。在本发明的第三方面,提供了:(27)一种磁共振造影剂,其包含根据(1)至(26)中的任一项所述的脂质体和药用载体。在一个优选的实施方案中,提供了:(28)根据(27)所述的磁共振造影剂,其中所述药用载体是水性载体。在本发明的第四方面,提供了:(29)根据(27)或(28)所述的磁共振造影剂,用于医学,例如诊断中。在本发明的第五方面,提供了:(30)根据(1)至(26)中任一项所述的脂质体在制备磁共振造影剂中的应用,所述磁共振造影剂用于增强哺乳动物中的器官和器官结构的磁共振图像。该第五实施方案的优选方面包括:(31)根据(30)所述的应用,用于制备增强哺乳动物中的肿瘤的磁共振图像的磁共振造影剂。(32)根据(30)或(31)所述的应用,其中在所述磁共振造影剂中的所述脂质体的浓度为1-50mg/mL,更优选1-30mg/mL。在本发明的第六方面,提供了:(33)一种对哺乳动物中的器官或器官结构进行磁共振成像的方法,所述方法包括以下步骤:(a)将根据(27)或(28)所述的磁共振造影剂给予患者;和(b)获取(拍摄,take)所述患者中的关注器官的图像。该第六实施方案的优选方面包括:(34)根据(33)所述的方法,其中所述磁共振造影剂被用于增强哺乳动物中的肿瘤的磁共振图像。(35)根据(33)或(34)所述的方法,其中在所述磁共振造影剂中的脂质体的浓度为1-50mg/mL,更优选1-30mg/mL。在本发明的第七方面,提供了:(36)一种对哺乳动物中的器官或器官结构进行磁共振成像的方法,所述哺乳动物被预先给予根据(27)或(28)所述的磁性造影剂,所述方法包括以下步骤:(i)获取所述患者中的关注器官的图像。在本发明的第八方面,提供了:(37)一种制备根据(1)至(26)所述的脂质体的方法,所述方法包括混合Gd.DOTA.DSA(2-{4,7-二羧甲基-10-[(N,N-二硬脂酰氨基甲基-N`-酰氨基-甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基}-乙酸钆(III))的溶液和中性的完全饱和磷脂的溶液。第八实施方案的一个优选方面包括:(38)干燥所述混合物(例如在真空中),并任选地再水合所得到的脂质体。在本发明的第九方面,提供了:(39)一种制备根据(27)或(28)所述的磁性造影剂的方法,所述方法包括混合(1)至(26)所述的脂质体和药用载体。第八和第九实施方案的优选方面与上面关于第一、第二和第三方面列出的那些相同。发明详细描述我们现在将更详细地讨论本发明。通过参照图1-29,也可以进一步理解本发明,其中:图1显示了由FDA批准的基于钆的临床造影剂;图2显示了从两性脂质的脂质体形成;图3显示了Gd.DOTA.Chol,一种MAGfect的T₁脂质造影剂组分;图4显示了顺磁性钆脂质靶标Gd.DOTA.DSA;图5显示了Gd.DOTA.DSA的电喷雾质谱图,m/z:1117.2(M-H),Gd的同位素峰显示在右上角中;图6显示了Gd.DOTA.DSAxa02的HPLC迹线:t_R=36.22min,柱C-4肽;梯度混合物A=MeCN/0.1%TFA;混合物B=H₂O/TFA;混合物C=MeOH,0.0min[100%B],15-25.0min[100%A],25.1-45.0min[100%C];流速1mL/min;图7描绘了EPR,其中正常组织不具有宽度足以允许大分子或纳米粒剂泄漏入胞外组织衬里血管中的内皮间隙,而肿瘤组织具有破裂的内皮层,允许更大的颗粒“渗”入肿瘤胞外结构域中;图8提供了本发明的优选脂质体之一(脂质体A,一种具有肿瘤成像用途的新型MRI活性脂质体)的描绘;图9描绘了形成本发明的优选脂质体之一(脂质体A)的脂质的结构;图10显示了胆固醇脂质对脂质体双层渗透性和刚度的影响;图11显示了脂质体A颗粒的尺寸分布;图12显示了在肾LCCxa0PK1细胞上的MTT细胞活力测定的结果,其中使用处于不同剂量的本发明的脂质体A颗粒和三个温育期;图13显示了在HepG2肝细胞上的MTT细胞活力测定的结果,其中使用处于不同剂量的本发明的脂质体A颗粒和三个温育期;图14显示了在肾LCCxa0PK1细胞上的LDH测定中获得的结果,其中使用处于不同剂量的本发明的脂质体A颗粒和三个温育期;图15显示了在HepG2肝细胞上的LDH测定获得的结果,其中使用处于不同剂量的本发明的脂质体A颗粒和三个温育时段;图16呈现了携带肿瘤的小鼠在注射包含脂质体A的制剂以后的不同时期的磁共振图像,其中虚线白色圆圈标记肿瘤面积,而白色箭头指向肿瘤位置;图17显示了在其中获得图16的图像的24小时MRI实验内,在脂质体A给予后,在各个TR时间点的%肿瘤信号强度的曲线图;图18显示了在其中获得图16的图像的24小时MRI实验内,在脂质体A给予后,肿瘤信号强度增加随时间的曲线图;图19显示了在脂质体A给予后,在切开的IGROV-1肿瘤上的荧光显微术的结果;在左图中显示了荧光图像,而在右图中描绘了H&E(苏木精和伊红)染色(X400);图20提供了本发明的优选脂质体之一(脂质体B,一种新型MRI活性脂质体,其具有叶酸受体部分,且具有肿瘤成像用途)的描绘;图21描绘了形成本发明的优选脂质体之一(脂质体B)的脂质的结构;图22显示了用于α-FR表达的四种细胞系的FACS分析的结果;图23是柱状图,显示了由用具有不同mol%的叶酸靶向脂质的脂质体B温育以后的IGROV-1细胞摄入的Gd的量;图24呈现了脂质体B的尺寸和多分散性分布的数据;图25是曲线图,显示了在LCCxa0PK1细胞中用不同剂量的脂质体B颗粒和三个温育期的MTT测定的结果;图26是曲线图,显示了在LCCxa0PK1细胞中用不同剂量的脂质体B颗粒和三个温育期的LDH细胞毒性测定的结果;图27呈现了携带肿瘤的小鼠在注射包含脂质体B的制剂以后的不同时期的磁共振图像,其中虚线白色圆圈标记肿瘤位置;图28显示了在其中获得图27的图像的24小时MRI实验内,在脂质体B给予后的不同TR时间点的%肿瘤信号强度的曲线图(N=3);和图29显示了在脂质体B给予后在切开的IGROV-1肿瘤上的荧光显微术的结果;在左图中显示了荧光图像,而在右图中描绘了H&E染色(X400);Gd.DOTA.DSA的有前途的T₁弛豫数据,导致开发使用Gd.DOTA.DSA的钆脂质体制剂,用于体内全身循环,其目的是,利用广泛报道的增强的渗透和滞留(EPR)效应,通过MRI进行肿瘤成像。这导致开发本发明的新型Gd.DOTA.DSA脂质体系统,其特征在于,所述脂质体还包含中性的、完全饱和磷脂组分。我们已经令人惊讶地发现,通过将中性的、完全饱和磷脂组分掺入本发明的Gd.DOTA.DSA脂质体系统中,所得到的脂质体更小,且获得更同质的脂质体制剂,所述制剂因此具有用于制备磁共振造影剂的理想性质。适用于构建本发明的Gd.DOTA.DSA脂质体的恰当中性的、完全饱和磷脂通常是1,2-二(C₁₂-C₂₀饱和脂质)-sn-甘油-3-磷酰胆碱。更优选的实例包括1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DSPC)或1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DMPC)脂质。1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DSPC)是最优选的。通常,在所述脂质体中的完全饱和磷脂组分的量为总脂质体制剂的32-34mol%,并且最优选地,它是33mol%。通常,在所述脂质体中的Gd.DOTA.DSA组分的量为总脂质体制剂的29-31mol%,并且最优选地,它是30mol%。通常,所述脂质体具有100nm或更小的尺寸。通过以此方式小心地纳米工程化脂质体,以确保它们的尺寸保持在100nm以下,由于肿瘤组织的特性,认为该尺寸范围对于脂质体在实体瘤中的积累而言是最佳的。认为肿瘤组织对大分子试剂具有普遍亲和力,称作增强的渗透和滞留效应(EPR),因此大分子试剂在肿瘤组织中积累。Maeda等人¹³在这点上首次介绍了EPR;据信,诸如增加的血管生成、异质和破坏的血管基础结构、受损的淋巴排出系统和“泄漏的”内皮层等肿瘤性质都是有助于大分子结构在肿瘤组织内积累的因素(参见图7)。如下面进一步解释和例举的,这因此相对于现有技术MRI活性脂质体和非脂质体顺磁性造影剂提供特殊的、实质性的优点。EPR效应已经成为用于将大分子药物和聚合物或脂质体大分子靶向肿瘤的标准模型。通过修饰它们以包括用于信号定位的成像探针或部分,可以容易地使这些试剂适用于肿瘤成像。与诸如Gd.DTPA(马根维显^TM)等低分子量试剂(它们通过扩散在血液中再循环,并在注射后的相对短时间期内通过肾脏清除)相反,这里的关键机理是,大分子在实体瘤中滞留。在肿瘤组织内的该滞留效应或颗粒积累也称作被动靶向,且已经证实,由于此有效的现象,非常高水平(10-50倍)的聚合物药物可以在几天内积累在肿瘤部位¹⁴。纳米颗粒在肿瘤组织中的肿瘤积累的机理,已经被确立为大分子通过破裂的内皮衬里肿瘤血管的外渗。除了符合肿瘤外渗尺寸阈值以外,将脂质体尺寸保持在用于体内注射的100nm范围内的进一步原因是由于大脂质体通过肝脏清除。大脂质体被包括肝细胞和肝巨噬细胞的肝脏细胞摄取,脂质体颗粒可以积累在肝脏或脾组织中,这是由于这些器官中的较大内皮衬里。优选地,可以将胆固醇掺入制剂中,因为这种脂质会在脂质体双层上诱导各种各样的效应。已经证实胆固醇会增加脂质体制剂中的头基间距,并使所得到的双层膜稳定⁹。这里,在脂质体制剂中的胆固醇存在通过诱导脂质链的构象排序来控制流动和刚性双层二者的膜渗透性(图10)。另外,作为它的中性电荷的直接结果,胆固醇可以减少血清诱导的聚集¹⁰。通常,在所述脂质体中的胆固醇组分的量为总脂质体制剂的29-31mol%,并且最优选地,它是30mol%。为了延长脂质体纳米颗粒的循环时间以确保最大肿瘤暴露,还可以使用聚乙二醇-磷脂连接的构造,将聚乙二醇(PEG)锚入脂质体双层中。用于本发明的脂质体中的优选的聚乙二醇-磷脂的实例包括DSPE-PEG(2000)[二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(2000)]。已经证实,具有用中性的亲水性PEG聚合物修饰的表面的脂质体会受益于延长的循环时间,其中据报道,在啮齿动物中的半衰期是2-24h,并且在人中高达45h¹¹。这方面的理论是,表面接枝PEG的脂质体具有减少的由肝脏细胞的摄入,因为该脂质体未被血浆蛋白有效地结合¹²。这些脂质体也称作空间上稳定化的脂质体。这里,PEG层在空间上抑制血浆组分与脂质体双层的静电和疏水性相互作用。通常,所述脂质体中的聚乙二醇-磷脂组分的量为总脂质体制剂的5-8mol%,并且最优选地,它是7mol%。对于体内目的而言,已经将具有中性头基的完全饱和磷脂掺入脂质体制剂中;如上所述,这些包括但不限于:1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DSPC)或1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DMPC)脂质。除了在脂质体制剂中掺入5-10摩尔比的聚乙二醇化的脂质以外,中性脂质的使用提供来自血液血浆蛋白如调理素的空间稳定化和保护,并导致肝巨噬细胞(Kupfferxa0cell)摄取的减少。认为通过在脂质体表面周围形成聚合物分子的高度水合的屏蔽而发生稳定化。由于该“屏蔽”特性,这些类型的脂质体经常被称作“隐蔽(stealth)”脂质体。在本发明的进一步实施方案中,本发明的脂质体可以进一步掺入肿瘤靶向剂。包含肿瘤靶向剂的本发明的脂质体通常包含用于受体的配体,相对于所述受体在哺乳动物的非肿瘤组织细胞中的表达,所述受体在肿瘤细胞中被过表达。这样的肿瘤靶向剂的一个实例是包含叶酸部分的肿瘤靶向剂。在本发明的优选实施例中,肿瘤靶向剂是磷脂-聚乙二醇-叶酸化合物。更优选地,该磷脂-聚乙二醇-叶酸化合物是DSPE-PEG(2000)-叶酸[二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(2000)-叶酸]。通常,脂质体中存在的叶酸部分的量为总脂质体制剂的1-2mol%。作为肿瘤靶向剂的一个实例,叶酸是这样的靶向部分的一个良好实例;因为基于叶酸的靶向系统提供将治疗剂或成像剂选择性地递送至肿瘤的有效方式¹⁵。已经证实,处于晚期的侵袭性的或未分化的肿瘤具有增大的叶酸受体(FR)密度,表明癌症疗法可以受益于FR介导的药物递送所提供的宽泛途径¹⁶。FR在几种癌症类型如脑癌、肾癌、肺癌和乳腺癌,并且尤其是在上皮癌如卵巢癌中过表达¹⁷。FR配体叶酸(或叶酸)是一种维生素,其被用于核苷酸的生物合成,且以高水平被利用以满足增殖癌细胞的需要¹⁸。除了众多药物递送努力以外,叶酸靶向技术已经成功地应用于治疗剂的放射成像¹⁹、癌细胞的荧光成像²⁰、MRI造影剂²¹和钆脂质体²²。Choi等人已经证实了叶酸靶向的氧化铁纳米颗粒用于诱发的KB肿瘤成像的用途,并证实了这些颗粒与对照相比具有38%的信号强度增加²³。最近证实了使用非靶向的双模态脂质体造影剂的成功肿瘤MRI,由此观察到尺寸为约100nm的双模态顺磁性和荧光脂质体在卵巢癌的小鼠异种移植物模型中积累²⁴。由于广泛报道的增强的渗透和滞留效应(EPR),脂质体能够在肿瘤组织内积累,这依赖于约40kDa及以上的胶态大分子在肿瘤中的被动积累²⁵。由于异常的肿瘤内皮而产生EPR效应,作为它的“泄漏”的结果,允许纳米颗粒渗透到肿瘤组织中。通过使用受体靶向部分(其要么后结合于脂质体表面,要么连接于掺入脂质体双层内的脂质),而可以提高脂质体在肿瘤组织中的积累。由于当FR的配体叶酸经由其γ-羧基结合到成像剂或治疗部分上时,FR结合亲和力(Kd=1×1^-10M)似乎不受影响²⁶,连接在脂质PEG两亲物的远端末端上的叶酸配体允许开发FR靶向的脂质体系统。认为人鼻咽KB癌细胞系具有最高的FR表达水平,然而与具有最高频率(>90%的病例)的卵巢癌相比,该癌症的病例的数量较低²⁷。尤其,作为锚定糖基磷脂酰肌醇(GPI)的膜蛋白的α-FR亚型在卵巢癌中被高度表达²⁸。另外,还已经证实,α-FR亚型具有特定生物标志物值,有助于鉴别转移性肿瘤部位起源²⁹。因此,我们对使用该受体感兴趣,以便测试叶酸靶向的双模态脂质体对于使用MRI的卵巢肿瘤成像的效力。已经广泛地研究了基于叶酸的脂质体药物递送³⁰,然而,尚未在很大程度上实时动态地研究由于叶酸靶向导致的脂质体在肿瘤中的积累的速率增强效应。预见到有效的肿瘤信号增强,因为FR在正常组织(主要限于肾小管、肺上皮和胎盘组织)中以显著更低的量表达³¹。为了评估靶向配体对脂质体在实体瘤中的积累的速率和程度的增加值,在本发明中,已经配制了FR靶向的双模态荧光和顺磁性脂质体,并通过MRI和荧光显微术与非靶向的脂质体进行对比。我们已经发现,它们获得非常良好的结果,具有低毒性、优良的靶向MR信号增强,且在肿瘤中初步快速积累以后,造影剂此后从身体快速且自然地清除。在本发明的第三方面,还提供了一种磁共振造影剂,其包含根据本发明的第一和第二方面中的任一个的脂质体和药用载体。通常,所述药用载体是水性载体,如HEPES[(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸]缓冲溶液。在本发明的第四方面,提供了根据第三方面的磁共振剂,其用于医学,优选地用于诊断,并且特别优选地用于对器官和器官结构(例如肿瘤)成像。在本发明的第五方面,提供了根据本发明的第一和第二方面中的任一个的脂质体在制备磁共振造影剂中的应用,所述磁共振造影剂用于增强哺乳动物中的器官和器官结构的磁共振图像。本发明的脂质体特别用于制备用于增强哺乳动物中的肿瘤的磁共振图像的磁共振造影剂。如上面已经描述的和下面进一步例证的,本发明的顺磁性脂质体具有优良的性质,这是由于它们的最佳尺寸(由于EPR效应导致的在肿瘤中增加的积累,和由于减少的通过肝巨噬细胞的摄取导致降低的肝毒性)、更大的稳定性、更强的钆螯合作用,同时它们的非离子性质减少以前使用离子型钆造影剂已经观察到的理化后果,其中过量的负电荷导致体内竞争反应和Gd³⁺的置换。因此,本发明的磁共振造影剂相对于现有技术顺磁性钆造影剂提供实质性的且令人惊讶的优点,因为它们具有优良的图像增强能力,而同时表现出大大提高的安全性特性,这归因于减小的需要的钆的剂量,因为本发明的钆脂质体逐渐积累在肿瘤组织中,而不积累在其它器官、特别是肝脏中。作为更大有效性联合更低毒性的结果,本发明的造影剂可以提供比迄今已知的试剂在临床上更宽范围的磁共振定向成像。通常,本发明的磁共振造影剂中的脂质体浓度是1-50mg/mL,更优选是1-30mg/mL,但是本发明不限于这些范围。用于制备该磁共振造影剂的制剂中的药用载体的实例是水性载体如HEPES。在本发明的第六方面,还提供了一种对哺乳动物的器官或器官结构进行磁共振成像的方法,所述方法包括以下步骤:(a)将根据本发明的第三方面的磁共振造影剂给予患者;和(b)获取所述患者中的关注器官的图像。同样,所述方法通常被用于增强哺乳动物中的肿瘤的磁共振图像。我们通常使用的磁共振造影剂中的脂质体浓度是1-50mg/mL、更优选是1-30mg/mL,但是本发明不限于该范围。参照下述实施例,可以进一步理解本发明。实施例实施例1脂质体A图8中描绘了脂质体A。脂质体A是一种具有肿瘤成像能力的新型MRI活性脂质体,我们将在下面进行证实。脂质体A制剂由Gd.DOTA.DSA/DSPC/胆固醇/DSPExa0PEG2000:30/33/30/7mol%组成。对于临床前组织学研究,还将1mol%DOPE-罗丹明加入到该制剂中,并且使用32mol%的DSPC。通过MRI,使脂质体A显影以观察体内肿瘤组织的信号增强。构成该脂质体系统的脂质的结构在图9中显示。通过将顺磁性脂质Gd.DOTA.DSA掺入该脂质体制剂中而实现MRI信号增强。脂质体A表征在毒性测定之前,按照图11,测量颗粒的尺寸分布。在图11中,在下图中显示了在各种PBS稀释液中的脂质体A粒度,而在上图中显示了对照颗粒的粒度。脂质体A制剂由Gd.DOTA.DSA/DSPC/胆固醇/DSPE_PEG2000:30/33/30/7mol%组成,并且对照纳米颗粒是DOTA.DSA/DSPC/胆固醇/DSPE_PEG2000:30/33/30/7mol%。NB:在通过0.2μm过滤器过滤以后,去除了在1000nm+处的峰(数据未显示)。脂质体A和对照颗粒(没有与DOTA头基螯合的Gd)都是非常稳定的,且在PBS中在各种稀释度时的尺寸都在100nm以下。所述颗粒还具有非常低的多分散性指数,表明是均匀且同质的样品。测得的脂质体A的尺寸小于以前公开的DOPC脂质体,且多分散性指数(PdI)也远远低于对于含有DOPC的相同制剂所测得的结果(参见表2)。这表明,该新的DSPC制剂提供更小的尺寸分布,这对于脂质体的肝清除和在肿瘤组织内的逐渐积累是更有利的,并且更低的多分散性指数也证实更同质和均匀的脂质体样品。ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>表2.用DOPC配制的中性聚乙二醇化脂质体。体外毒理学研究使用MTT和LDH毒性测定,评估了脂质体A和具有相同组成但没有螯合在DOTA大环中的Gd的对照纳米颗粒的体外毒性。所述脂质体以25mgxa0mL^-1的总浓度在缓冲液[20mMxa0HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸],pHxa06.8,150mMxa0NaCl)中配制。MTT细胞活力测定细胞增殖和活力的确定是对于细胞群体对外界因素的应答的体外测定评估的关键领域,因此进行MTT测定以测量脂质体A对细胞活力的影响。MTT测定测量细胞增殖速率,以及相反地,当代谢事件导致细胞凋亡或坏死时,测量细胞活力(增殖和细胞死亡之间的平衡)的减少。这种测定涉及通过线粒体脱氢酶对四唑盐的还原。通过脱氢酶的作用,代谢活性的细胞将黄色四唑MTT(溴化3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基四唑)转化成紫色产物甲ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="54"/>(formazan)。得到的细胞内的紫色甲臢可以溶解并分光光度计地进行定量。以此方式,可以测量和定量在加入的钆脂质体存在下细胞的生存力。以2.5xxa010^-5细胞/mL,将2个细胞系LLC-PK1肾细胞和Hepxa0G2肝细胞接种在96孔平板中,并测定之前在生长介质中温育24h。然后,以0.004-1.0mgxa0mL^-1的浓度,将脂质体A加入到细胞中,并将细胞温育6、24和48h。确定细胞毒性,并且数据如图12所示。在肾LLCxa0PK1细胞上的MTT活力测定,揭示了在加入所述脂质体以后的良好的细胞活力水平,并证实活力仅在更高剂量和温育期下降。脂质体A的毒性低于对照纳米颗粒,这种效应可能是由于脂质体A制剂中的DOTA头基的羧酸与Gd³⁺螯合,并因此在细胞环境内变成中性的和相对惰性的。作为加入脂质体A或对照纳米颗粒的结果,HepG2细胞活力受到微小影响(图13)。但是,脂质体A毒性低于对照纳米颗粒,其中在更高剂量和更长温育期下观察到细胞活力下降(图13的上图)。乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性测定LDH测定是一种非放射性的定量地测量LDH的比色细胞毒性测定,LDH是一种稳定的细胞溶质酶,该酶在细胞死亡期间在细胞裂解后被释放。使用30-分钟偶联酶促测定来测量释放在细胞介质中的LDH的量,其导致四唑盐(INT)转化成红色甲臢产物。形成的颜色的量与裂解细胞的数量以及因此的死亡细胞的数量成比例。然后相对于对照如从没有向其添加化合物的细胞释放出的LDH,将结果标准化。图14呈现了对照纳米颗粒和脂质体A在肾LLCxa0PK1细胞上的NCLxa0LDH测定结果。图14中的数据证实,在较低剂量范围和温育期(4h),细胞毒性较低。与对照纳米颗粒相比,脂质体A看起来具有更低的毒性。对照脂质体的细胞毒性对于对照纳米颗粒更易变化,并且看起来相比于脂质体A,这些颗粒对HepG2肝脏细胞的毒性更大(图15,上图)。在所有浓度和温育期下,脂质体A的HepG2毒性和因此的肝毒性看起来十分低。这些数据证实了脂质体A的总体低毒性。体内肿瘤成像人癌症的小鼠肿瘤是用于初步研究成像剂和它们作为肿瘤信号增强剂的有效性的良好模型。使用人卵巢癌细胞系IGROV-1在Balb/c裸鼠中诱导肿瘤。这里,将细胞在6-8周龄雌性小鼠的右胁下方注射,并且在2周以后,该小鼠已经生长出适合成像的足够大肿瘤。在HEPES缓冲液中制备脂质体A颗粒,并通过携带肿瘤的小鼠的尾静脉进行注射,一种确保脂质体快速进入血液循环中的方法。在注射之前,在4.7T磁体上获得基线MRI扫描以鉴别肿瘤和测量基线信号强度值。脂质体注射后,接着在注射后2h、16h和24h,对小鼠进行成像。获得每个时间点的T₁-加权图像,并从由肿瘤组织产生的肿瘤信号强度值,计算由于脂质体在肿瘤组织内的积累导致的信号强度增强百分比(参见图16)。图16呈现了携带肿瘤的小鼠的MR图像,在注射脂质体A之前,肿瘤看起来为黑色,并且在脂质体给予后,变得更增强。这种效应持续至实验的24h终点。图17进一步证实了脂质体A的肿瘤信号增强,其中在不同的TR时间点,肿瘤信号强度看起来随时间一致地升高,这证实了由于EPR效应导致的脂质体A在肿瘤中的逐渐积累。当这个数据在图18中表示为肿瘤信号强度增加时,我们可以看到,肿瘤信号强度在24h内增加,并且直到实验的24h终点,实现了72%信号增加。该数据是非常令人难忘的,并证实了根据本发明的脂质体A作为“被动”靶向的肿瘤成像剂的效用。在注射后24h,处死小鼠,并切除它们的肿瘤。将肿瘤冷冻,固定,并进行低温切片,其中切出7m切片,并使用显微术在载玻片上分析它们的荧光。在脂质体A制剂中包括红色荧光脂质DOPE-罗丹明,允许在肿瘤组织内的脂质体定位的双模态评估。如鉴于MRI研究所预期的,肿瘤切片的组织学分析揭示了肿瘤组织中非常高水平的荧光信号(参见图19)。在肿瘤组织内出现高荧光信号是可观察的。这些荧光强度结果提供了与MR图像的定性可见一致性,并验证了脂质体A在异种移植肿瘤内的积累。肿瘤组织具有用大开窗术的微血管,因而所述脂质体能够外渗到肿瘤中。这些外渗的脂质体由于受损的淋巴排出系统而不能被清除,且可以随时间积累在肿瘤胞外流体内。结论脂质体A是一种能够通过MRI进行有效肿瘤成像的新型脂质体纳米颗粒制剂。DSPC(一种用于本发明的Gd.DOTA.DSA脂质体的完全饱和磷脂)的掺入获得优良的结果。这些结果清楚地证实,脂质体A具有低肝毒性和非常高的MRI信号增强活性。这被认为是由于脂质体A(本发明的一种典型Gd.DOTA.DSA脂质体)的最佳尺寸,因为它足够小而由于EPR效应积累在肿瘤中,且该较小的尺寸还防止它积累在肝脏中,特别是由于肝巨噬细胞摄取的减少。实施例2xa0脂质体B在进一步的实验中,我们开发了另一种肿瘤靶向的MRI活性脂质体,下文称作脂质体B。脂质体B是一种用于MRI的新型肿瘤靶向的脂质体纳米颗粒。作为我们的靶向-脂质体研究调查的一部分,我们开发了叶酸-靶向的顺磁性脂质体,即脂质体B(参见图20中脂质体B的描绘),其在叶酸-受体表达肿瘤模型中显示出增强的积累。配制所述颗粒,以确保在低多分散性指数下的大约100nm的尺寸分布。使用IGROV-1细胞来在Balb/c裸小鼠中诱导肿瘤,并静脉内地注射该叶酸-靶向的脂质体。观察到与非靶向脂质体相比,叶酸-靶向的脂质体在肿瘤组织内的快速积累。脂质体B的制剂与脂质体A类似,除了DSPE-PEG2000隐密脂质的摩尔百分比减少了1.5mol%,以便掺入靶向两亲物:DSPE-PEG-2000(叶酸)[二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(2000)-叶酸](关于颗粒组成,参见图21)。认为人鼻咽KB癌细胞系具有最高水平的FR表达,而与具有最高频率(>90%的病例)的卵巢癌相比,这种癌症的病例的数量太低²⁷。尤其,α-FR亚型(它是糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定膜蛋白)在卵巢癌中高度表达²⁸。另外,还已经证实,α-FR亚型具有特定生物标志物值,这有助于鉴别转移性肿瘤部位起源²⁹。因此,我们对使用该受体感兴趣,以便测试叶酸靶向的双模态脂质体用于使用MRI对卵巢肿瘤成像的效力。已经广泛地研究了基于叶酸的脂质体药物递送³⁰,然而,尚未在很大程度上实时动态地研究由于叶酸靶向导致的脂质体在肿瘤中的积累的速率增强效应。预见到有效的肿瘤信号增强,因为FR在正常组织(主要限于肾小管、肺上皮和胎盘组织)中以显著更低的量表达³¹。为了评估靶向配体对脂质体在实体瘤中的积累的速率和程度的增加值,配制了FR靶向的双模态荧光和顺磁性脂质体,并通过MRI和荧光显微术与非靶向脂质体进行对比。为了确立IGROV-1细胞系(一种人卵巢癌细胞系)是否表达足够水平的叶酸受体,进行4种不同的细胞系的FACS分析。为此目的,选择作为正常组织中具有有限表达水平的叶酸运载体的α-叶酸受体(α-FR)亚型。为了测量人卵巢细胞系IGROV-1、OVCAR-3和HeLa(宫颈癌)细胞的α-FR表达水平,进行了流式细胞术实验。除了这些细胞系以外,还分析了乳腺癌细胞系(SKBR-3),作为不具有α-FR表达的阴性对照细胞系。细胞在无叶酸介质中生长,并用血清温育以阻断任何非特异性的相互作用。用对α-FR特异性的单克隆抗体(MAbxa0Mov18/ZEL)进行免疫染色,并在用该抗体温育以后,第二种FITC标记的抗体(FITC结合的山羊抗体IgG)与细胞一起温育。染色后,固定细胞,并通过荧光显微术进行分析。从FACSα-FR表达分析(参见图22),其中使用无叶酸细胞培养基在相同的标准化条件下培养所有细胞系,,其证实了,IGROV-1细胞系表现出明显更高水平的α-FR表达。从这些典型的FACS数据,测得下述次序的α-FR表达:IGROV-1>>OVCAR-3>HeLa>SKBR-3(接种后3天)。已经确立α-FR在IGROV-1细胞系上过表达后,制备脂质体B靶向的脂质体,用于特异性的细胞受体结合和摄入到IGROV-1肿瘤癌细胞中。在MR成像前,初步优化叶酸靶向两亲物的百分比。表3显示了用于与IGROV-1细胞一起温育而配制的一系列具有不同的叶酸两亲物的脂质体。叶酸盐配体优化实验中使用的脂质体ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>表3:具有不同mol%的DSPE-PEG2000靶向脂质的脂质体BTM的制剂。对于配体优化实验,将表3所示的脂质体B脂质体加入到培养基中的IGROV-1细胞,并温育6h。在该温育期后,洗涤细胞,裂解,并进行它们的¹⁵⁷Gd含量的ICP-MS测量。图23呈现了获得的数据。从该数据我们可以看出,具有最高摄取到IGROV-1细胞中的脂质体制剂是含有1.5mol%的DSPE-PEG-2000(叶酸)的制剂。我们以前公开的工作使用了掺入DOPC和3mol%的DSPE-PEG-2000(叶酸)靶向配体的中性聚乙二醇化的脂质体,然而,脂质体B需要一半的靶向配体,这显著降低生产成本。因而,可以看出,由于需要仅一半数量的靶向配体导致的这种成本降低,代表了通过在本发明的脂质体中使用完全饱和磷脂如DSPC提供的另外的优点。脂质体B是一种掺入了优化比率的靶向配体的新型制剂,使用从其生长肿瘤的相同细胞系建立,用于体内MR成像实验。已经优化脂质体B脂质体的靶向配体比率后,接着表征该脂质体的尺寸和分布。图24呈现了关于脂质体B颗粒的尺寸表征的数据。这些颗粒具有大约100nm的平均尺寸,其中经过滤的颗粒具有优良的多分散性指数。体外毒性在LLCxa0PK1肾细胞上的MTT试验在脂质体B脂质体上进行,并且在大多数剂量和温育时间,细胞活力不受很大程度的影响(参见图25)。更高的剂量和温育期确实导致细胞活力降低,表明最佳剂量范围在0.001至0.5mg/mL之间。LDH测定数据如图26所示,这里脂质体B的毒性效应在48h温育期下看起来变得远远更显著。脂质体B脂质体的弛豫率脂质体B脂质体的弛豫率如下测量:通过用不同浓度的Gd.DOTA.DSA脂质配制脂质体,以获得具有在1.972-0.2466mM范围内的原子Gd浓度的5种制剂。脂质体B和含有DOPC脂质的叶酸靶向脂质体(按照我们以前的公开(Bioconjugatexa0Chem.2009,20,648-655))的弛豫率如表4所示。作为MRI活性Gd脂质,在两种制剂中的Gd.DOTA.DSA及其浓度是相同的,在4.7T下获得的r₁和r₂弛豫率是相当的。ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>表4:脂质体B脂质体与含有DSPC和叶酸靶向DOPC的脂质体的弛豫率对比体内肿瘤MRI在HEPES缓冲液(20mM,NaCl,135mM,pHxa06.5)中制备脂质体B颗粒(总脂质体浓度;15mgxa0mL^-1),并通过IGROV-1肿瘤携带小鼠的尾静脉进行注射。在注射之前,在4.7T磁体上获得基线MRI扫描,以便鉴别肿瘤和测量T₁基线值。然后在注射后以2h、16h和24h间隔时间对小鼠进行成像。从由所述肿瘤产生的信号强度,计算由于脂质体B颗粒在肿瘤组织内的积累导致的信号增强百分比。图27呈现了在注射前、在脂质体B给予后2、16和24h的肿瘤的MR图像。这些肿瘤图像揭示在24h时间点处在肿瘤区域周围的增强信号的明亮边缘,这证实了根据本发明的叶酸受体靶向的顺磁性脂质体B的极大有效性。测得的肿瘤信号强度值(参见图28)显示了在静脉内注射后仅2h内,叶酸脂质体的活性且特异性靶向效应是明显的,其中肿瘤信号增强了20%。此后持续增大直到16h成像时间点,其中实现62%的肿瘤信号增强。与以前的含有DOPC-3mol%DSPE-PEG2000(叶酸)的脂质体相比,尽管注射含有一半量的叶酸靶向配体的脂质体B颗粒,但还是观察到这种大幅增强。脂质体B的进一步的新颖性和实用性从以下事实得到证实:在肿瘤信号强度中的16h峰以后,肿瘤信号开始下降。尽管在脂质体A的情况下,肿瘤信号强度增大直到24终点,但脂质体B的这种降低肿瘤信号强度效应是有利的,因为在成像以后,颗粒从肿瘤被“自然地”清除,这是对任何安全的且生物相容性的纳米颗粒的要求。尽管使用靶向配体可以实现在肿瘤部位的更快积累速率和剂量,但是最近的报道已经将注意力投向靶向的纳米颗粒的延长积累和滞留的安全性。我们认为,脂质体B是一种最佳的MRI活性脂质体纳米颗粒,其在μM剂量范围内可以大幅增强肿瘤组织,在信号增强饱和点之后清除,并表现出相对于目前临床上可用的小分子量MRI造影剂的优势。IGROV-1肿瘤的组织学在MRI以后,接着处死小鼠,并切出肿瘤,冷冻,固定,和切片,用于组织学分析。在脂质体制剂中包含荧光DOPE-罗丹明脂质,允许通过荧光显微术进行死后分析,所述荧光显微术是在肿瘤组织内存在脂质体的灵敏指示。图29呈现了在脂质体B注射后24h,切片的肿瘤的荧光显微术图像。来自这些切开的肿瘤切片的强烈红色荧光的存在,指示靶向的B脂质体在肿瘤组织中积累。这些发现表明,用于肿瘤的体内成像的叶酸靶向提供用于肿瘤成像的牢固且广阔的平台。结论在对于实体瘤的有效成像总是更佳的纳米颗粒的寻找中,对粒度、电荷和靶向要素的考虑是对于用于肿瘤成像的成功颗粒开发的关键要求。实验1和2的结果确实证实,本发明的新型脂质体表现出使它们特别适合用作肿瘤磁共振成像的造影剂的最佳性质。实验材料磷脂酰乙醇胺-丽丝胺罗丹明B(DOPE-罗丹明)、胆固醇、二硬脂酰基磷酰胆碱(DSPC)和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱-N-甲氧基(聚乙二醇)-2000(DSPE-PEG2000)购自Avantixa0Polarxa0Lipidsxa0Inc.(Alabaster,AL,USA)。所有其它化学试剂是分析级或可得到的最好等级,并且购自Sigma-Aldrich(UK)或Macrocyclics(USA)。Gd.DOTA.DSA如下合成。通用程序在400MHzxa0Brukerxa0Advancexa0400光谱仪上,记录¹Hxa0NMR谱。使用残余氯仿(7.27ppm)作为积分标准,从TMS的低场以百万分率(ppm)报告化学位移。数据支持如下:化学位移,s=单峰,br=宽单峰,d=双峰,t=三重峰,q=四重峰,m=多重峰,以赫兹(Hz)为单位给出耦合常数J。在400MHzxa0Brukerxa0Advancexa0400光谱仪上记录¹³Cxa0NMR谱。使用CDCl₃的中间共振(77.0ppm)作为积分标准,从TMS的低场以百万分率(ppm)报告化学位移。在JASCOxa0FT/IR-620红外分光光度计上记录红外(IR)波谱;以波数记录吸收(νmax,cm^-1)。在装配有Polymerxa0Laboratoriesxa0PL-ELS1000蒸发光散射检测器的Hitachi-LaChromxa0L-7150泵系统上进行分析型HPLC。HPLC梯度混合物指定如下:梯度混合物A=H₂O/0.1%TFA;混合物B=MeCN/0.1%TFA;混合物C=MeOH。使用VG-070B、Joelxa0SX-102或Brukerxa0Esquirexa03000xa0ESI仪器实施质谱。在Stuartxa0Scientificxa0SMP3设备上确定熔点并在没有校正下报告。通过标准注射器技术,实施与空气敏感材料的反应。在P₂O₅上蒸馏CH₂Cl₂。在Merckxa00.2mm铝支撑硅胶60xa0F254板上进行薄层色谱(TLC)分析,并通过用UV光照射或通过用高锰酸钾、酸性钼(IV)酸铵、碘、茚三酮、罗丹明B、稀硫酸水溶液或溴甲酚绿染色,使这些组分显影,其中使用适当的Pharmaciaxa0LKB-Ultrospecxa0III(在300nm的氘灯)来使UV吸光度可视化。使用Merckxa00.040-0.063mm、230至400目硅胶来实施快速柱色谱法。在Nickonxa0Eclipsexa0E600显微镜上进行显微术实验。在Bectonxa0Dickinsonxa0FACSCalibur机器上进行FACS分析。在4.7xa0Txa0Magnex磁体(Oxford,UK)Varianxa0Unityxa0Inova操作台(Paloxa0Alto,CA,USA)上进行所有MRI实验。依照英国总部规则和动物手术(科学程序)法案的指南(1986)(Guidancexa0forxa0thexa0Operationxa0ofxa0Animals(Scientificxa0Procedures)Act(1986)),进行对动物的所有程序。方案1显示用于制备提出的脂质体纳米颗粒的唯一内部合成组分(Gd.DOTA.DSA脂质4)所采用的合成路线。如通过分析型HPLC评估的,制备的该脂质具有约98%的纯度。ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="534"/>方案1xa0a:3当量Et₃N,干燥CH₂Cl₂,45°C,12h,68%。b:6xa0H₂O.GdCl₃,H₂O,90°C,12h,定量。化学合成:(i)2-{4,7-二羧甲基-10-[(N,N-二硬脂酰氨基甲基-N`-酰氨基甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基}-乙酸(DOTA.DSA)(3)ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>将DOTA-NHS-酯(100mg,0.120mmol)和双(硬脂酰胺)(80.17mgxa00.139mmol)加入抽真空的烧瓶中,向其中加入无水CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub>(40ml)。然后加入三乙胺(66.90l,0.480mmol),并在N<sub>2</sub>气氛下将反应搅拌过夜。在真空中除去溶剂,并通过快速柱色谱法(用(CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub>∶MeOH∶NH3xa034.5∶9∶1)∶CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub>xa01∶9→9∶1,v/v洗脱)纯化粗混合物,得到白色固体.Rf[CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub>∶MeOH∶H<sub>2</sub>O:34.5∶9∶1v/v]0.61。<sup>1</sup>Hxa0NMR(400MHz,CDCl<sub>3</sub>∶MeOD∶AcOD:3∶1,300K)δH(ppm)10.55(3H,s,br,3×COOH),5.30(1H,s,br,CH<sub>2</sub>NHCOO),3.65(6H,m,3×NCH<sub>2</sub>COOH),3.22(6H,m,2×NCH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>,1×NCH<sub>2</sub>CONH),2.58(16H,s,br,4×NCH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>N),2.29(2H,s,br,CH<sub>2</sub>NH),1.67-1.59(4H,m,OCNCH<sub>2</sub>CH<sub>2</sub>),1.46-1.44(27H,s中的d,Jxa06.0,C(CH<sub>3</sub>)3×3),1.25(60H,s,链CH<sub>2</sub>的),0.90(6H,t,Jxa06.8,CH<sub>3</sub>xxa02)。FTIR:νmax(奴约耳(nujol))/cm<sup>-1</sup>xa03750.56,2726.56,1889.87,1793.63,1681.21,1534.22。HPLC:tR=34.16min,柱C-4肽,梯度混合物:0.0min[100%A],15-25.0min[100%B],25.1-45.0min[100%C],45.1-55.0min[100%A];流速:1mL/min。对54H104N6O8计算HRMS(FAB+):m/zxa0964.7916,文献值987.7833(M+Na)<sup>+</sup>。(ii)2-{4,7-二羧甲基-10-[(N,N-二硬脂酰氨基甲基-N`-酰氨基-甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基}-乙酸钆(III)(Gd.DOTA.DSA)(4)ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>将化学计量量的GdCl₃.6H₂O(28.118mg,0.075mmol)加入DOTA.DSA(3)(73mg,0.0757mmol)中,并将反应物在蒸馏的H₂O(20mL)中在90°C搅拌过夜(在钆加入以后,pH下降至3.5)。将所述水(溶液)冷冻干燥,以产生白色粉末(83.9mg,99%产率,分解=345-348°C)。Rf[CH₂Cl₂∶MeOH∶H₂O:34.5∶9∶1xa0v/v]0.55。二甲酚橙试验指示没有可检测的游离Gd³⁺离子。FTIR:νmax(奴约耳)/cm^-1xa03750.23,2234.78,1991.59,1889.89,1793.44,1681.90.77。HPLC:tR=36.22min,柱C-4肽,梯度混合物:0.0min[100%A],15-25.0min[100%B],25.1-45.0min[100%C],45.1-55.0min[100%A];流速:1mL/min。对C54H101GdN6O8计算的MS(ESI+):m/zxa01119.67,文献值1120.10(M+H)⁺。(iii)N,N-二硬脂酰氨基甲基氨基甲酸叔丁基酯(2a)ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>将Boc-甘氨酸(310mg,1.77mmol)和二十八烷基胺(923.96mg,1.77mmol)溶解于干燥氯仿(30ml)中。将HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐)(804.12mg,2.12mmol)和DMAP(4-二甲氨基吡啶)(648.72mg,5.31mmol)加入该溶液中,并将反应在室温、N₂下搅拌12h。在真空下除去溶剂。将混合物溶解于CH₂Cl₂(50mL)中,并用H₂O(3×50mL)萃取。用2∶1xa0CH₂Cl₂∶MeOH(2×50mL)反萃取合并的水性萃取物,减少溶剂,并重新溶解于二乙醚中,随后实施用7%柠檬酸和H₂O的萃取;用盐水洗涤有机层,收集,并通过硅藻土(C-盐,celite)过滤,最后在MgSO₄上干燥。在真空下蒸发二乙醚,而得到纯的白色固体(1.164g,97%产率,熔点=82-85°C)。Rf[CH₂Cl₂∶MeOH∶H₂O:34.5∶9∶1v/v]0.56。¹Hxa0NMR(400MHz,CDCl₃)δH(ppm)5.50(1H,s,br,酰胺NH),3.99(2H,s,br,NHCH₂),3.35-3.25(2H,d,br,OCNCH₂),3.17-3.07(2H,d,br,OCNCH₂),1.44(9H,s,C(CH₃)₃),1.61-1.44(13H,m,C(CH₃)₃和OCN(CH₂CH₂)),1.25(60H,s,CH₂的烷基链),0.872(6H,s,br,CH₃xxa02)。¹³Cxa0NMR(400MHz,CDCl₃)δC(ppm)167.6(CON(CH₂)17),156.0(C(CH₃)₃COCO),79.0(C(CH₃)₃),46.9(N(CH₂CH₂)9),46.1(N(CH₂CH₂)9),42.2(NHCH₂CO),31.9-26.9(CH₂xxa030),22.7(N(CH₂CH₂)9),14.1(C(CH3)3)。FTIR:νmax(奴约耳)/cm^-1xa02360.56,1723.85,1650.78,1580.63,1377.25。HPLC:tR=36.08min,柱C-4肽,梯度混合物:0.0min[100%A],15-25.0min[100%B],25.1-45.0min[100%C],45.1-55.0min[100%A];流速:1mL/min。对于C43H86N2O3计算的HRMS(FAB+):m/zxa0678.6638,文献值679.6953(M+H)⁺。(iv)N,N-二硬脂酰氨基甲胺(DSA)(2)ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>将经保护的胺2a溶解于无水CH₂Cl₂(5mL)中,向其中加入三氟醋酸(3mL)。将该反应物在N₂气氛下搅拌2h。在真空下除去溶剂,并在真空下干燥产物,而得到白色粉末(158mg,94%产率,熔点=59-64°C)。Rf[己烷∶乙酸乙酯:9∶1v/v]0.44。¹Hxa0NMR(400MHz,CDCl3)δH(ppm)3.85(2H,s,OCCH₂NH₂),3.32(2H,t,Jxa07.2Hz,OCNCH₂CH₂),3.13(2H,t,Jxa07.2Hz,OCNCH₂CH₂),2.39(2H,s,非常br,NH₂),1.61-1.55(4H,m,OCNCH₂CH₂),1.26(60H,s,链CH₂的),0.86(6H,t,Jxa06.8,CH₃×2)。¹³Cxa0NMR(400MHz,CDCl3)δC(ppm)168.8(CO),43.7(OCNxa0CH₂),41.9(OCNCH₂),35.6(CH₃CH₂CH₂),33.4(烷基链CH₂的),32.3,31.1(NCH₂CH₂CH₂),22.7-14.1(烷基链CH₂的)。FTIR:νmax(奴约耳)/cm^-1xa01681,1534,1313,1206,1174.HPLC:R=31.46min,柱C-4肽,梯度混合物:0.0min[100%A],15-25.0min[100%B],25.1-45.0min[100%C],45.1-55.0min[100%A];流速:1mL/min。对于C38H78N2O计算的HRMS(FAB+):m/zxa0578.6114,文献值579.6199(M+H)⁺。由于脂质4的顺磁性质,所以NMR波谱法不适合作为表征工具,这归因于由顺磁性钆金属引起的极大峰增宽。通过电喷雾质谱法(ESI-MS)、HPLC分析所有钆脂质,并使用二甲酚橙测定来测试在产物样品中任何游离Gd³⁺的存在。二甲酚橙测定是一种比色分析试验,其中从橙色至紫色的颜色变化是Gd³⁺与二甲酚橙染料的络合的指示。这会引起从440nm至573nm的红移。这里,通过使用已知钆浓度相对于吸光度的标准校正曲线,由此可以评估样品中的游离Gd³⁺的量。如图5和图6所示,进行Gd.DOTA.DSAxa04的HPLC和MS分析,并且证实没有游离的Gd³⁺存在,并且制备的化合物具有98%纯度和优良的产率。在MS迹线中还可见到钆的同位素峰,并因此,观察到钆的大量同位素证实了该金属与DOTA脂质的络合。化合物4的HPLC、MS和同位素钆峰显示在图5和图6中。二甲酚橙实验通过测量二甲酚橙溶液(990μL,0.5mM,在醋酸钠缓冲液(0.1M,pHxa05.2)中)和含有Gd化合物(10μL)的试验溶液(在1∶1xa0MeOH∶CH₂Cl₂中)的混合物在573nm的吸光度,来测定在Gd掺入化合物中游离钆离子的存在。消光系数ε=20,700Lxa0mol^-1xa0cm^-1,其中[游离Gd]=A573/ε。Gd.DOTA.DSA的MRI分析。对于T₁分析,将Gd.DOTA.DSAxa04、Gd.DTPA.BSA、和无金属的化合物对照、以及马根维显(Scheringxa0AG,Germany)加入水中,以得到0.5mM的终浓度。将这些溶液(200μL)放入埃彭道夫管(eppendorftube)中,并在环境温度在4.7Txa0Varianxa0MR扫描仪上测量T₁弛豫值。对于弛豫率测量,制备钆脂质体制剂,以便得到在200μL蒸馏水中的在0.20至0.66M之间的5个不同钆浓度,并测定摩尔弛豫率r₁(mM^-1xa0s^-1)。使用如下进行的饱和恢复实验而得到T₁值:使用标准的自旋回波序列和2mm单个切片获取(TR=50,100,200,300,500,700,1200,3000,5000,7000ms,TE=15ms),信号平均数:2,FOV:70×70mm²,集中到256×128矩阵中。脂质体制备。在-20°C,在氩气下,所有脂质作为在无水有机溶剂(CHCl₃、MeOH或二者的混合物)中的储备溶液进行储存。将适当体积的每种脂质储液放入含有氯仿的圆底烧瓶中,并搅拌,以确保脂质的充分混合。在真空下缓慢地除去溶剂,以确保产生均匀脂质膜。以确定体积(20mL/500mg脂质体)的缓冲液(HEPES,NaCl,150mM,pHxa06.8)再水合该膜。将得到的溶液声处理60min(在30°C)。通过pH计(Camlabxa0Ltd.,Over,Cambridgeshire,UK),检查该脂质体悬浮液的pH。对于每个制剂,通过光子相关光谱法(PCS)测量脂质体的尺寸和多分散性。小鼠肿瘤模型。将IGROV-1细胞(5xxa010⁶/0.1mLxa0PBS)植入6-8周龄Balb/c裸鼠的胁下,用于产生皮下肿瘤。在约2周后(估测的肿瘤重量为40-50mg),用异氟醚/O₂混合物麻醉小鼠,并放入求积分¹H容积线圈中,并定位到磁体中。获得基线扫描,然后经由侧尾静脉将小鼠静脉内地注射200μL脂质体溶液(HEPES(20mM,NaClxa0135mM,pHxa06.5)),并在4.7T(自旋回波序列:TR=400-2800ms,TE=10ms,FOV=45xxa045cm²,平均值:1,矩阵尺寸:256×128厚度:2.0mm,和20个切片)进行成像。组织学实验。在MRI以后,处死动物,并切出肿瘤、肝脏和肾脏,在液氮中冷冻,嵌入OCT(VWR)包埋流体中,并切割10或7m厚的切片,装在载玻片上,并进行荧光显微术研究。参考文献¹Shah,K.;Jacobs,A.;Breakefield,X.O.;Weissleder,R.Molecularxa0imagingxa0ofxa0genexa0therapyxa0forxa0cancer(癌症的基因疗法的分子成像).Genexa0Therapyxa02004,11,1175-1187.²Massoud,T.F.;Gambhir,S.S.Molecularxa0imagingxa0inxa0livingxa0subjects:seeingxa0fundamentalxa0biologicalxa0processesxa0inxa0axa0newxa0light(在活受试者中的分子成像:观察在新光中的基础生物学过程).Genesxa0&xa0Developmentxa02003,17,545-580.³Caravan,P.;Ellison,J.J.;McMurry,T.J.;Lauffer,R.B.Gadolinium(III)chelatesxa0asxa0MRIxa0contrastxa0agents:Structure,dynamics,andxa0applications(作为MRI造影剂的钆(III)螯合物:结构、动力学和应用).Chemicalxa0Reviewsxa01999,99,2293-2352.⁴Parac-Vogt,T.N.;Kimpe,K.;Laurent,S.;Pierart,C.;Elst,L.V.;Muller,R.N.;Binnemans,K.Europeanxa0Journalxa0ofxa0Inorganicxa0Chemistryxa02004,3538-3543⁵Tilcock,C.,Unger,E.,Cullis,P.和MacDougall,P.Radiologyxa01989,17⁶Oliver,M.;Ahmad,A.;Kamaly,N.;Perouzel,E.;Caussin,A.;Keller,M.;Herlihy,A.;Bell,J.;Miller,A.D.;Jorgensen,M.R.Organicxa0andxa0Biomolecularxa0Chemistryxa02006,4,3489-3497⁷Kabalka,G.W.,Davis,M.A.,Holmberg,E.,Maruyama,K.和Huang,L.Magneticxa0Resonancexa0Imagingxa01991,9,373377⁸E.Cxa0Unger,T.A.F.,C.Tilcock,T.E.Newxa0Journalxa0ofxa0Magneticxa0Resonancexa0Imagingxa01991,6,689-693⁹Bhattacharya,S.;Haldar,S.Biochimicaxa0Etxa0Biophysicaxa0Actaxa02000,1467,39-53¹⁰Lian,T.;Ho,R.J.Y.Journalxa0ofxa0Pharmaceuticalxa0Sciencesxa02001,90,667-680.¹¹Moghimi,S.M.;Szebeni,J.Progressxa0inxa0Lipidxa0Researchxa02003,42,463-478.¹²Scherphof,G.L.;Velinova,M.;Kamps,J.;Donga,J.见Liposomexa0researchxa0days:Towardsxa0newxa0productsxa0forxa0humanxa0health(脂质体研究时代:走向人类健康的新产物);Hirota,S.,编;Elsevier:Shizuoka;Japan,1996,第179-192页.¹³Maeda,H.;Wu,J.;Sawa,T.;Matsumura,Y.;Hori,K.见Recentxa0advancesxa0inxa0drugxa0deliveryxa0systems(药物递送系统的最新进展);Anderson,J.M.,Kim,S.W.,Kopecek,J.,Robinson,J.R.,编;Elsevier:Saltxa0Lakexa0City,UT,1999,第271-284页¹⁴Iyer,A.K.;Khaled,G.;Fang,J.;Maeda,H.Drugxa0Discoveryxa0Todayxa02006,11,812-818¹⁵Ke,C.Y.,Mathias,C.J.,和Green,M.A.(2004)Folate-receptor-targetedxa0radionuclidexa0imagingxa0agents(叶酸-受体靶向的放射性核素成像剂).Adv.Drugxa0Deliveryxa0Rev.56,1143-1160.Reddy,J.A.,Allagadda,V.M.,和Leamon,C.P.(2005)Targetingxa0Therapeuticxa0andxa0Imagingxa0Agentsxa0toxa0Folatexa0Receptorxa0Positivexa0Tumours(将治疗剂和成像剂靶向叶酸受体阳性的肿瘤).Curr.xa0Pharm.Biotechnol.6,131-150.Wang,Z.J.,Boddington,S.,Wendland,M.,Meier,R.,Corot,C.,和Daldrup-link,H.(2008)MRxa0imagingxa0ofxa0ovarianxa0tumoursxa0usingxa0folate-receptor-targetedxa0contrastxa0agents(使用叶酸-受体靶向的造影剂对卵巢肿瘤进行MR成像).Pediatricxa0Radiol.38,529-537.Saul,J.M.,Annapragada,A.V.,和Bellamkonda,R.V.(2006)Axa0dual-ligandxa0approachxa0forxa0enhancingxa0targetingxa0selectivityxa0ofxa0therapeuticxa0nanocarriers(用于增强治疗用纳米载体的靶向选择性的双配体方案).J.Controlledxa0Releasexa0114,277287.Ghaghada,K.B.,Saul,J.,Na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